1. הקדמה

אבקת ארטמיסינין טבעית 63968-64-9 היא צמח מרפא שנמצא בשימוש ברפואה הסינית המסורתית במשך יותר מ-2000 שנה לטיפול בהפרעות רבות כולל מלריה. ארטמיסינין הוא המרכיב העיקרי בתמצית Artemisia annua. הבידוד של ארטמיסינין מ-Artemisia annua L. ואפיון ההשפעה האנטי-מלריה שלו בשנות ה-70 היה ביוזמת מדענים סינים, שנחשבת לאחת ההתקדמות החשובות ביותר בשליטה במלריה בעת החדשה. אבקת ארטמיסינין נמצאת בשימוש נרחב בתחום המזון, התרופות והקוסמטיקה.

ארטמיסין היא תרכובת אורגנית עם נוסחה מולקולרית של C15H22O5 ומשקל מולקולרי יחסי של 282.34. [1]

ארטמיסינין הוא גביש מחט חסר צבע עם נקודת התכה של 156 ~ 157 מעלות. הוא מסיס בקלות בכלורופורם, אצטון, אתיל אצטט ובנזן, מסיס באתנול ובאתר, מסיס מעט באתר נפט קר וכמעט בלתי מסיס במים. בגלל קבוצת הפרוקסי המיוחדת שלו, הוא לא יציב לחימום וקל לפירוק בהשפעת לחות, חום וחומרים מפחיתים. [1]

ארטמיסינין היא התרופה היעילה ביותר לטיפול בעמידות לתרופות למלריה. הטיפול המשולב המבוסס על ארטמיסינין הוא גם האמצעי היעיל והחשוב ביותר לטיפול במלריה כיום. אבל בשנים האחרונות, עם העמקת המחקר, התגלו ויושמו יותר ויותר השפעות אחרות של ארטמיסינין, כמו אנטי גידול, טיפול ביתר לחץ דם ריאתי, נוגד סוכרת, רעילות עוברית, אנטי פטרייתי, ויסות חיסוני, אנטי ויראלי [{{ 1}}], אנטי דלקתי, אנטי פיברוזיס ריאתי, אנטיבקטריאלי, השפעות קרדיווסקולריות והשפעות פרמקולוגיות אחרות [2].

באוקטובר 2015 זכתה Tu Youyou בפרס נובל לפיזיולוגיה או רפואה לשנת 2015 עם שני מדענים נוספים על תרומתה ליצירת תרופות חדשות נגד מלריה - ארטמיסינין ודיהידרוארטמיסינין. [5

רקע מחקרי

מלריה היא אחת המחלות העתיקות ביותר של בני אדם, והיא עדיין בעיית בריאות ציבורית חשובה שיש לה דאגה נרחבת ודחוף להיפתר בעולם.

בשנת 1631, המיסיונר האיטלקי אגוסטינו סלומברינו השיג תרופה יעילה לטיפול בחום מתושבי פרו בדרום אמריקה - צ'ינצ'ונברק, והחזיר אותה לאירופה לטיפול בחום. עד מהרה נמצא כי לתרופה הייתה השפעת הקלה ברורה על חום לסירוגין.

בשנת 1820 בודדו פייר ג'וזף, כימאי צרפתי, וג'וזף ביאנאים א-קאונטו, מדען תרופות, את המרכיב היעיל לטיפול במלריה מקליפת הסינצ'ונה וקראו לו כינין.

בשנת 1944, הכימאים האורגניים האמריקאים רוברט וודוורד וויליאם דורינג הצליחו לסנתז כינין בפעם הראשונה. מאז, מדענים שיפרו ללא הרף תרופות נוגדות מלריה, ויצרו מתנולים ארומטיים והטרוציקליים המיוצגים על ידי כינין, 4-אמינוקינולינים המיוצגים על ידי כלורוקין ואמינופנולים הטרוציקליים המיוצגים על ידי אמודיאקין. תרופות אלה נגד מלריה מילאו תפקיד חשוב בשליטה במלריה אנושית. עם זאת, עם השימוש הנרחב וארוך הטווח בתרופות, צצה בהדרגה בעיית העמידות לתרופות של טפילי מלריה.

בתחילת שנות ה-60, Plasmodium falciparum פיתח עמידות לכלורוקין באזורים מסוימים, במיוחד בדרום מזרח אסיה. באותה תקופה, עם ההסלמה ההדרגתית של מלחמת וייטנאם, התקפת מלריה פלציפרום עמידה לכלורוקין הטרידה את הצדדים הלוחמים, והביאה למספר רב של צמצומים בכוחות הלוחמים. לשם כך השקיעה ארצות הברית משאבים אנושיים וחומריים רבים לחקר המלריה, כשהמטרה העיקרית היא למצוא תרופות חדשות נגד מלריה. ביניהם, מכון המחקר של צבא וולטר ריד של ארצות הברית סנן יותר מ-200,000 תרכובות מאז סוף שנות ה-60. בשל תנאים מוגבלים, וייטנאם אינה מסוגלת לפתח תרופות חדשות, ולכן ביקשה מסין לסייע בפתרון בעיית השליטה במלריה. הצד הסיני שלח חוקרים לבצע חקירות בשטח וסיוע בשטח במשך כמעט שנתיים, תוך הבנה של הדחיפות והמורכבות של הדברת המלריה.

גילוי של ארטמיסינין

בין ה-21 במאי ל-1 ביוני 1971, התקיים בגואנגג'ואו הסימפוזיון הלאומי לשליטה ומניעת מלריה. לאחר הסימפוזיון, מכון בייג'ינג לרפואה סינית מסורתית ארגן מחדש את צוות המחקר. Tu Youyou עדיין היה ראש הצוות, וחברי הצוות Zhong Yurong המשיכו לחלץ את הרפואה הסינית המסורתית. לאנג לינפו וליו ג'ופו ערכו ניסויים בבעלי חיים. על פי רישומי בדיקת התרופות של המכון לרפואה סינית מסורתית בבייג'ין, שיעור העיכוב של ארטמיסינין היה 12 אחוז ב-26 ביולי 1971 (מס' 16), 40 אחוז ב-1 בספטמבר (מס' 114) ו-100 אחוז ב-4 באוקטובר (מס' 191). מאז ינואר 1971, הצוות של Tu Youyou החל לחלץ כמות גדולה של תמצית אתר של artemisia annua, והשלים את בדיקת הרעילות על כלבים בסוף יוני אותה שנה. על מנת לבצע את הניסוי הקליני בהקדם האפשרי, בעוד שתוצאות בדיקת הרעילות של תמצית אתר ארטמיסינין על כלבים באותה שנה עדיין שנויות במחלוקת, Tu Youyou, Lang Linfu, Yue Fengxian ו- Zhang Guozhen, Yan Shuchang, Pan Hengjie , Zhao Aihua ו-Fang Wenxian לקחו ברציפות את התמצית הנייטרלית של אתר ארטמיסינין בשתי קבוצות במינונים שונים, ללא תופעות לוואי רעילות ברורות.

ב-8 במרץ 1972, טו Youyou, כנציג של המכון לרפואה סינית מסורתית בבייג'ינג, פרסם דו"ח שכותרתו "השתמש במחשבת מאו דזה-דונג כדי להנחות את חקר רפואת הצמחים הסינית נגד מלריה" במפגש של "משרד 523 הלאומי" בנאנג'ינג, ודיווחו על התוצאות של שיעור עיכוב של 100 אחוז של מלריה של חולדות ומלריה של קופים של התמצית הגולמית הנייטרלית של אתר ארטמיסינין, שמשכה את תשומת הלב של כל המשתתפים. על פי הנתונים, טו Youyou קיבל השראה מהרפואה הסינית המסורתית ומהאמירה העממית של "מיץ סחט". בהתחשב בכך שהמרכיבים היעילים עשויים להיות בחלק הליפופילי, היא שינתה למיצוי אתר, אשר שיפרה משמעותית את עוצמת החיות של Artemisia annua מ-30 אחוז ל-40 אחוז ליותר מ-95 אחוז.

באוגוסט 1972, Tu Youyou הוביל צוות לביצוע בדיקת היעילות הקלינית של תמצית ארטמיסינין נייטרלי באי היינאן. במהלך תקופה זו, Ni Muyun עיצב את הטיפול המקדים של הפרדת עמודות כרומטוגרפית כדי לשפר שוב את ההשפעה האנטי מלריה של החלק הנייטרלי של תמצית האתר של Artemisia annua. ג'ונג יורונג למד מהספרות שעמודת סיליקה ג'ל יעילה יותר בהפרדת תרכובות ניטרליות, ולכן הוא ועוזרו Cui Shulian השתמשו בכרומטוגרפיה של עמודת סיליקה ג'ל ובסילוק שיפוע של אתר נפט-אתיל (אחר כך שונה לאתר נפט-אתיל אצטט) לפי לשיטה הניתנת בספרות להפרדת תמצית האתר הנייטרלית על בסיס הטיפול הטרום-טור של Ni Muyun.

ב-8 בנובמבר 1972, עמודת סיליקה ג'ל שיוצרה על ידי Shanghai Reagent Factory שימשה להפרדה, ולאחר מכן שימשו אתר נפט ואתיל אצטט-נפט (פרופורציות שונות) לאלוציה במשך פעמים רבות. תחילה התקבלה כמות קטנה של גבישים דמויי מחט, שמספרם "גביש מחט I" (מס' 1 או מחט 1); מספר הגבישים דמויי המחט שנפלטו לאחר מכן הוא "גביש מחט II" (מס' 2 או מחט 2); בהמשך התקבל גביש מרובע נוסף שמספרו "קריסטל III" (מס' 3 או גביש מרובע). בתחילת דצמבר של אותה שנה, בדיקת המלריה של עכברים הוכיחה כי "גביש מחט II" הוא המונומר היעיל היחיד בעל השפעה אנטי מלריה. מאז, כאשר המכון לרפואה סינית מסורתית בבייג'ינג דיווח ל"משרד הלאומי 523", הוא שינה את המרכיב היעיל של "גביש מחט II" נגד מלריה ל"ארטמיסינין II", המכונה לעתים גם ארטמיסינין. מאוחר יותר, המכון לרפואה סינית מסורתית בבייג'ינג נקרא "ארטמיסינין II" ארטמיסינין.

2. פונקציה עיקרית

1. Antimalarial, אבקת artemisinin יש השפעה הרג על הטפיל בתוך תאי דם אדומים, זה יכול לעכב את הבשלות של הטפיל במהירות;

2. אנטיבקטריאלי, לארטמיסינין יש השפעה נגד וירוס שפעת;

3. אנטי טפיל, ארטמיסינין על התפקיד של אנטי סכיסטוזומיאזיס ולפטוספירוזיס.

3.יישום

1. אבקת ארטמיסינין טבעית 63968-64-9 המיושמת בתחום המזון, אבקת ארטמיסינין יכולה לפעול כחומרי גלם של תה להפחתת הליחה;

2. מיושם בתחום התרופות, זה הופך לתרופה חדשה נגד סרטן עם רעילות נמוכה;

3. מיושם בתחום קוסמטי, זה יכול להמריץ את זרימת הדם ולהסיר משקה.

4. מפרט

פריטים	דרישות	תוצאות
תיאור
מראה חיצוני:	אבקה גבישית לבנה עד אוף-וויט.	תואם
מְסִיסוּת	מסיס בחופשיות באצטון ובחומצה קרחונית, מסיס במתנול, אתנול, אתנול דליל, אתר או אתר נפט, כמעט בלתי מסיס במים	תואם
נקודת המסה	תואר 150-153	150.9-151.8 מעלות
אופטי ספציפי רוֹטַציָה	פלוס 75 מעלות - פלוס 78 מעלות	פלוס 77.1 מעלות
זיהוי
תגובת צבע	נוצר צבע סגול	תואם
תגובת צבע	נוצר צבע אדום-סגול עמוק	תואם
HPLC	זמן השמירה של השיא העיקרי בהכנה למבחן צריך התאמה לזה של תקן העבודה כפי שהתקבל מבדיקה על ידי בדיקת HPLC	תואם
IR	ספקטרום ה-IR של המדגם צריך להיות תואם את ספקטרום ה-IR של תקן העבודה של ארטמיסינין	תואם
מבחנים
חומרים קשורים (HPLC)	Artemisitene פחות או שווה ל-0.15 אחוז {{0}}אפימר של ארטמיסינין פחות או שווה ל-0.3 אחוז כל טומאה בודדת פחות או שווה ל-{{0}}.15 אחוז סה"כ זיהומים פחות או שווה ל-1.0 אחוז	{{0}}.07 אחוז NA 0.1 אחוז 0.75 אחוז

5. תרשים זרימה

חומרי גלם ← ניקוי ← התרסקות ← תמצית ← סינון ← תרכיז ← ריסוס יבש ← בדיקה ← אריזה

סינתזה כימית

סינתזה של ארטמיסינין מ-R - ( פלוס ) - ציטרונלל

סינתזה של ארטמיסינין מ-R - ( פלוס ) - ציטרונלל [11]

בשנת 1983, הכימאי HofheinzW ואחרים גילו את שיטת הסינתזה הכימית של ארטמיסינין באמצעות מחקר כימי. באמצעות (-) - 2-איזובוטנול כחומר גלם, תוצר הביניים הושג על ידי הכנסת קבוצות חמצן באמצעות תגובת פוטואוקסידציה, ולאחר מכן התוצר הסופי סונתז באמצעות תגובת מחזור. ישנם שני שלבים עיקריים מגבילי קצב בסינתזה של לקטונים ססקוויטרפן: קיפול ומחזוריות של גרעיני האב של ססקיטרפן; תהליך היווצרות של ססקוויטרפן לקטונים המכילים גשרי פרוקסי.

בשנת 1986, המדען הסיני Zhou Weishan סינתז ארטמיסינין מ-R - ( פלוס ) - ציטרונלל. עם זאת, בשל שלבי הסינתזה המסובכים והתשואה הכוללת הנמוכה, אפילו פחות מאחוז אחד, טרם מומשה הערכת ההיתכנות של התיעוש.

ביוסינתזה

ארטמיסינין קיים בפרחים ובעלים של רפואת הצמחים הסינית Artemisia annua, אך לא בגבעולים. זוהי תרכובת טרפן בעלת תכולה נמוכה מאוד, והמסלול הביוסינתטי שלה מורכב מאוד.

כיום ידוע כי הביוסינתזה של ארטמיסינין יכולה להתבצע בשלוש דרכים. האחת היא להגדיל את תכולת הארטמיסינין על ידי ויסות האנזימים המרכזיים השולטים על הביוסינתזה של ארטמיסינין והוספת מבשרי הביוסינתזה; השני הוא להפעיל את הגנים הנשלטים על ידי אנזימים מרכזיים, ולהגדיל משמעותית את תכולת הארטמיסינין; השלישי הוא להשתמש בהנדסה גנטית כדי לשנות גנים מרכזיים כדי לשפר את היעילות של האנזימים שהם שולטים בהם.

בתהליך הביוסינתזה, התוכן של ארטמיסינין מושפע מאוד מגורמים פיזיולוגיים ואקולוגיים כמו אור, הורמונים אקסוגניים, התמיינות ניצנים וכו'. גם לטמפרטורה יש השפעה רבה על הביוסינתזה. באמצעות מחקר ניסיוני, נמצא שתכולת הארטמיסינין בשתילי ארטמיסינין עולה ל-68 אחוז ב-40 מעלות לאחר טיפול של 36 שעות.

בנוסף לארטמיסינין, צמחים אחרים יכולים גם לסנתז ארטמיסינין. בשנת 2011, חוקרים סינתזו ארטמיסינין מטבק. בהשוואה לשיטות כימיות מסורתיות, הריאגנטים הכימיים המשמשים בשיטה זו מופחתים מאוד, מה שמועיל להגנת הסביבה. הקולטן של שיטת הביוסינתזה הזו הוא טבק, שהוא נפוץ יחסית בסין. לכן, מקור חומרי הגלם עשיר יחסית. עם זאת, חלק ממצעי התגובה בתהליך סינתזה של ארטמיסינין מטבק אינם ברורים, ויש צורך לפתח אותם. עם זאת, לשיטה סינתטית זו יש עדיין סיכויי יישום תעשייתיים טובים. [11]

גן ארטמיסינין מושתל ב-Escherichia coli, וה-Escherichia coli שעבר טרנספורמציה מייצר תרכובת ביניים, שיכולה להפוך לחומר הגלם של ארטמיסינין - חומצת ארטמיסינין לאחר מספר שלבי טיפול. לאחר החדרת אנזים מיוחד לשמרים, שמרים הפכו את תרכובת הביניים שהוזכרה לעיל לארטמיסינין. השרשרת הטכנולוגית של ייצור ארטמיסינין דרך התעשייה המיקרוביאלית התגבשה בעצם. המשמעות היא שמחיר הארטמיסינין יירד ב-90 אחוז. [12]

מיצוי וטיהור

תהליכי ההפרדה והטיהור כוללים בעיקר מיצוי בסיוע ממסים, מיצוי מחדש, מיצוי CO2 סופר קריטי וכרומטוגרפיה של מיצוי ממסים.

שיטת המיצוי והגיבוש מחדש של הממס מאמצת בדרך כלל שיטת בנזין ממס, שיטת אתנול ושיטת מיצוי מים אלקליים ושיטת משקעים חומצית לייצור, מה שמגדיל באופן משמעותי את קצב הניצול האפקטיבי של צמחי ארטמיסינין.

מיצוי מים אלקליים ושיטת משקעים חומציים: קח כמות מסוימת של אבקה יבשה של ענפי ועלים של Artemisia annua והוספה לאתנול לערבול ולמיצוי לקבלת תמיסת מיצוי האתנול, יבש אותה בלחץ מופחת, והמיס אותה באתר- תמיסת מים דו-פאזית להשגת ארטמיסינין וארטמיסינין בהתאמה. התשואה של ארטמיסינין בשיטה זו היא 90 אחוז, ושיעור המיצוי של ארטמיסינין הוא 57 אחוז.

שיטת אתנול: קח כמות מסוימת של אבקה מיובשת של ענפי ועלים של Artemisia annua, השרה אותה באתנול מדולל למשך 24 שעות, השג את תמצית האתנול, הזרקת אותה למכשיר המיצוי הרציף, ולאחר מכן חילץ אותה עם בנזין ממס המכיל בנזן ואתיל. אצטט לקבלת שלב האלכוהול ושלב המיצוי, שניתן למחזר, שלב המיצוי מוחלש בפחם פעיל, מסונן, והממס מוחזר, ולאחר מכן משיג את התמיסה המרוכזת, ולאחר מכן מצננים ומתגבשים לקבלת הגביש הגס של ארטמיסינין, ולאחר מכן להתגבש מחדש עם אתנול כדי להשיג את הארטמיסינין המוגמר. לשיטה זו יש יתרונות של תשואה גבוהה, עלות נמוכה, פחות שלבים, תפעול פשוט ובטיחות.

שיטת בנזין ממס: קח כמות מסוימת של אבקה יבשה של ענפי ועלים של Artemisia annua, השרו אותה ב-8 ~ 10 פעמים של 120 # בנזין ממס במשך 3 פעמים, קבל את תמצית הבנזין הממס, ואז פתח את הדחיסה ורכז אותה והנח אותה להתגבשות , קבל את הארטמיסינין הגולמי, שטף אותו עם כמות קטנה של 120 # בנזין ממס במשך פעמים רבות, וגבש 50 אחוז אתנול אלכוהול 2~3 פעמים, לבסוף קבל את גביש המחט הלבן של ארטמיסינין. שיטה זו פשוטה וקלה לשימוש בייצור המוני.

קיימות שלוש שיטות מיצוי לכרומטוגרפיה של מיצוי ממסים, דהיינו, כרומטוגרפיה של עמודת אצטון - סיליקה ג'ל, בנזין עם רתיחה נמוכה - כרומטוגרפיה של סיליקה ג'ל מורחב כדורי גס במיוחד, ומיצוי אתאן - אתאן/אצטוניטריל - כרומטוגרפיה של עמודת סיליקה ג'ל.

6. הסמכה

לאחר שנים של ייצור, החברה שלנו השיגה רישיון ייצור רלוונטי.

ISO